La cromatografia, també coneguda com "anàlisi cromatogràfica", "cromatografia", és un mètode de separació i anàlisi, que té una àmplia gamma d'aplicacions en química analítica, química orgànica, bioquímica i altres camps.
El fundador de la cromatografia és un botànic rus M.Tsvetter.El 1906, el botànic rus Zvetter va publicar els resultats del seu experiment: per separar els pigments vegetals, va abocar extracte d'èter de petroli que contenia pigments vegetals en un tub de vidre que contenia pols de carbonat de calci i el va eluir amb èter de petroli de dalt a baix.Com que els diferents pigments tenen diferents capacitats d'adsorció a la superfície de les partícules de carbonat de calci, amb el procés de lixiviació, els diferents pigments es mouen cap avall a diferents velocitats, formant així bandes de diferents colors.Es van separar els components del pigment.Va anomenar aquest mètode de separació cromatografia.
Representació esquemàtica d'un experiment de separació de pigments de fulles vegetals
Amb el desenvolupament continu dels mètodes de separació, cada cop més substàncies incolores es converteixen en objecte de separació, la cromatografia també va perdre gradualment el significat de "color", però el nom encara s'utilitza avui dia.
Classificació cromatogràfica
L'essència de la cromatografia és un procés en què les molècules a separar es divideixen i s'equilibren entre la fase estacionària i la fase mòbil.Les diferents substàncies es divideixen de manera diferent entre les dues fases, la qual cosa fa que es moguin a diferents velocitats amb la fase mòbil.Amb el moviment de la fase mòbil, els diferents components de la mescla es separen entre si en la fase estacionària.Depenent del mecanisme, es pot dividir en diverses categories.
1, segons la classificació d'estat físic de dues fases
Fase mòbil: cromatografia de gasos, cromatografia líquida, cromatografia de fluids supercrítics
Fase estacionària: gas-sòlid, gas-líquid;Líquid-sòlid, líquid-líquid
2, segons la forma de classificació de la fase estacionària
Cromatografia de columna: cromatografia de columna empaquetada, cromatografia de columna capil·lar, cromatografia de columna microempaquetada, cromatografia preparativa
Cromatografia plana: cromatografia de paper, cromatografia de capa fina, cromatografia de membrana de polímer
3, classificat segons el mecanisme de separació
Cromatografia d'adsorció: es separen diferents components segons les seves capacitats d'adsorció i desorció sobre els adsorbents.
Cromatografia de partició: Els diferents components es separen segons la seva solubilitat en el dissolvent
Cromatografia d'exclusió molecular: segons la mida de la mida molecular de la separació en cromatografia d'intercanvi iònic: diferents components de l'afinitat per a la separació de la resina d'intercanvi iònic
Cromatografia d'afinitat: Separació mitjançant la presència d'una afinitat específica entre macromolècules biològiques
Electroforesi capil·lar: els components es van separar segons les diferències de mobilitat i/o comportament de la partició
La cromatografia quiral s'utilitza per a la separació i anàlisi de fàrmacs quirals, que es poden dividir en tres categories: mètode de reactiu de derivatització quiral;Mètode additiu de fase mòbil quiral;Mètode de resolució de fase estacionària quiral
Terminologia bàsica per a la cromatografia
Les corbes obtingudes en representar els senyals de resposta dels components després de la detecció de la separació cromatogràfica en funció del temps s'anomenen cromatogrames.
Línia de base:En determinades condicions cromatogràfiques, la corba del senyal generada quan només la fase mòbil passa pel sistema detector s'anomena línia base, tal com es mostra a la línia ot.Quan la condició experimental era estable, la línia de base era una línia paral·lela a l'eix horitzontal.La línia de base reflecteix el soroll de l'instrument, principalment el detector, al llarg del temps.
Alçada del pic:la distància vertical entre el punt pic cromatogràfic i la línia base, indicada per h, tal com es mostra a la línia AB.
Amplada de la regió:L'amplada de la regió del pic cromatogràfic està directament relacionada amb l'eficiència de separació.Hi ha tres mètodes per descriure l'amplada del pic cromatogràfic: desviació estàndard σ, amplada del pic W i FWHM W1/2.
Desviació estàndard (σ):σ és la mitja distància entre els dos punts d'inflexió de la corba de distribució normal, i el valor de σ indica el grau de dispersió dels components lluny de la columna.Com més gran sigui el valor de σ, més dispersos són els components de l'efluent i pitjor serà l'efecte de separació.Per contra, els components de l'efluent estan concentrats i l'efecte de separació és bo.
Amplada del pic W:Els punts d'intersecció d'ambdós costats del pic cromatogràfic s'utilitzen com a línies tangents, i la intersecció a la línia de base s'anomena amplada del pic o amplada de la línia base, que també es pot expressar com a W, tal com es mostra a la figura IJ.Segons el principi de distribució normal, es pot demostrar que la relació entre l'amplada del pic i la desviació estàndard és W=4σ.
W1/2:L'amplada del pic a la meitat de l'alçada del pic s'anomena FWHM, tal com es mostra per a la distància de GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W es deriven de σ i s'utilitzen per calcular les àrees pics a més de mesurar l'efecte columna.La mesura de FWHM és més còmoda i més utilitzada.
breu resum
A partir de la corba cromatogràfica del pic de sortida es poden assolir els següents objectius:
a, Es va realitzar una anàlisi qualitativa en funció del valor de retenció dels pics cromatogràfics
b, anàlisi quantitativa basada en l'àrea o pic del pic cromatogràfic
C. L'eficiència de separació de la columna es va avaluar segons el valor de retenció i l'amplada del pic del pic cromatogràfic.
La fórmula de càlcul implicada en la cromatografia
1. Valor de retenció
El valor de retenció és un paràmetre que s'utilitza per descriure el grau en què un component de la mostra es manté a la columna i s'utilitza com a indicador de la caracterització cromatogràfica.El seu mètode de representació és el següent:
Temps de retenció tR
Temps de la morttM
Ajustar el temps de retenció tR'=tR-tM
(Temps total passat en fase estacionària)
Volum de retenció
VR=tR*F. (independentment de la velocitat de la fase mòbil)
Volum mort
VM=tM*Fc
(L'espai no ocupat per la fase estacionària en el camí de flux des de l'injector fins al detector)
Ajusteu el volum de retenció VR'=t'R*Fc
2. Valor relatiu de retenció
El valor de retenció relativa, també conegut com a factor de separació, coeficient de partició o factor de capacitat relativa, és la relació entre el temps de retenció ajustat (volum) del component provat i el temps de retenció ajustat (volum) de l'estàndard en determinades condicions cromatogràfiques.
Els valors de retenció relativa es van utilitzar per eliminar la influència de determinades condicions de funcionament, com ara el cabal i la pèrdua de fixació, sobre els valors de retenció.L'estàndard en el valor de retenció relatiu pot ser un component de la mostra provada o un compost afegit artificialment.
3. Índex de retenció
L'índex de retenció és l'índex de retenció de la substància i que s'ha d'assajar en una solució fixa X. Es seleccionen dos n-alanes com a substàncies de referència, una de les quals té N nombre de carbonis i l'altra té N+n.El seu temps de retenció ajustat és t 'r (N) i t 'r (N+n), respectivament, de manera que el temps de retenció ajustat t 'r (i) de la substància i que s'ha d'assajar es troba exactament entre ells, és a dir, t'r (N).
L'índex de retenció es pot calcular de la següent manera.
4. Factor de capacitat (k)
En equilibri, la relació entre la massa d'un component en la fase estacionària (s) i la fase mòbil (m), anomenada factor de capacitat.La fórmula és la següent:
5、Coeficient de partició (K) En equilibri, la relació entre la concentració d'un component en la fase estacionària (s) i la fase mòbil (m), anomenat coeficient de partició.La fórmula és la següent
La relació entre K i k:
Reflecteix el tipus de columna i el seu nus propietats importants de l'estructura
breu resum
Relació entre el valor de retenció i el factor de capacitat i el coeficient de partició:
La separació cromatogràfica es basa en la diferència en la capacitat d'adsorció o dissolució de cada component en una mostra relativa fixa, que es pot expressar quantitativament per la mida del valor del coeficient de partició K (o factor de capacitat k).
Els components amb una forta capacitat d'adsorció o dissolució tenen un gran coeficient de partició (o factor de capacitat) i un llarg temps de retenció.Per contra, els components amb una adsorció o solubilitat febles tenen un petit coeficient de partició i un temps de retenció curt.
Teoria bàsica de la cromatografia
1. Teoria de la safata
(1) Presentar -- teoria termodinàmica
Va començar amb el model de placa de torre proposat per Martin i Synge.
Columna de fraccionament: a la safata durant diverses vegades d'equilibri gas-líquid, segons el punt d'ebullició de les diferents separacions.
Columna: els components estan equilibrats per múltiples particions entre les dues fases i separats segons diferents coeficients de partició.
(2) Hipòtesi
(1) Hi ha moltes safates a la columna i els components poden assolir ràpidament l'equilibri de distribució dins de l'interval de la safata (és a dir, l'alçada de la safata).
(2) La fase mòbil entra a la columna, no de manera contínua sinó pulsant, és a dir, cada passatge és un volum de columna.
(3) Quan es va afegir la mostra a cada placa de columna, es podria descuidar la difusió de la mostra al llarg de l'eix de la columna.
(4) El coeficient de partició és igual a totes les safates, independentment de la quantitat de components.És a dir, el coeficient de partició és constant a cada taban.
(3) Principi
Diagrama esquemàtic de la teoria de la safata
Si s'afegeix un component de massa unitària, és a dir, m=1 (per exemple, 1mg o 1μg), a la safata núm. 0, i després de l'equilibri de distribució, perquè k=1, és a dir, ns=nm, nm=ns=0,5.
Quan un volum de placa (lΔV) de gas portador entra a la placa 0 en forma de pulsació, el gas portador que conté el component nm a la fase gasosa s'empeny a la placa 1. En aquest moment, el component ns a la fase líquida de la placa 0 i el component nm de la fase gasosa de la placa 1 es redistribuirà entre les dues fases.Per tant, la quantitat total de components continguts a la placa 0 és de 0,5, en què les fases gasoses i líquides són 0,25 cadascuna, i la quantitat total continguda a la placa 1 també és de 0,5.Les fases gasosa i líquida també van ser de 0,25.
Aquest procés es repeteix cada vegada que un nou gas portador de volum de placa s'impulsa a la columna (vegeu la taula següent).
(4)Equació de la corba de sortida cromatogràfica
σ és la desviació estàndard, és el temps de retenció, C és la concentració en qualsevol moment,
C, és la concentració d'injecció, és a dir, la quantitat total de components (àrea de pic A).
(5) paràmetres d'eficiència de la columna
A un tR constant, com més petit és W o w 1/2 (és a dir, el pic més estret), més gran és el nombre de plaques teòriques n, més petita és l'alçada teòrica de la placa i més gran serà l'eficiència de separació de la columna.El mateix passa amb la teoria efectiva de la safata neff.Per tant, el nombre teòric de safates és un índex per avaluar l'eficiència de les columnes.
(5)Característiques i mancances
> Avantatges
La teoria de la safata és semiempírica i explica la forma de la corba de sortida
S'il·lustren els processos de partició i separació dels components
Es proposa un índex per avaluar l'eficiència de la columna
> Limitacions
Els components no poden arribar realment a l'equilibri de distribució en les dues fases:
La difusió longitudinal dels components a la columna no es pot ignorar:
No es va considerar la influència de diversos factors cinètics en el procés de transferència de massa.
La relació entre l'efecte de la columna i la velocitat del flux de la fase mòbil no es pot explicar:
No està clar quins factors principals afecten l'efecte columna
Aquests problemes es resolen satisfactòriament en la teoria de la taxa.
2. Teoria de la taxa
El 1956, l'estudiós holandès VanDeemter et al.va absorbir el concepte de teoria de la safata i va combinar els factors cinètics que afecten l'alçada de la safata, va presentar la teoria cinètica del procés cromatogràfic - teoria de la velocitat i va derivar l'equació de VanDeemter.Considera el procés cromatogràfic com un procés dinàmic sense equilibri i estudia la influència dels factors cinètics en l'eixamplament del pic (és a dir, l'efecte columna).
Més tard, Giddings i Snyder et al.va proposar l'equació de velocitat de cromatografia líquida (és a dir, l'equació de Giddings) basada en l'equació de VanDeemter (més tard anomenada equació de velocitat de cromatografia de gasos) i segons la diferència de propietats entre líquid i gas.
(1) Equació de Van Deemter
On: H: és l'alçada del tauler
A: coeficient del terme de difusió remolina
B: coeficient del terme de difusió molecular
C: coeficient del terme de resistència a la transferència de massa
(2) Equació de Giddings
Anàlisi quantitativa i qualitativa
(1) Anàlisi qualitativa
L'anàlisi cromatogràfica qualitativa consisteix a determinar els compostos representats per cada pic cromatogràfic.Com que diverses substàncies tenen valors de retenció definits en determinades condicions cromatogràfiques, el valor de retenció es pot utilitzar com a índex qualitatiu.Actualment, diversos mètodes cromatogràfics qualitatius es basen en valors de retenció.
Tanmateix, diferents substàncies poden tenir valors de retenció similars o idèntics en les mateixes condicions cromatogràfiques, és a dir, els valors de retenció no són exclusius.Per tant, és difícil caracteritzar una mostra completament desconeguda només a partir dels valors de retenció.Si a partir de la comprensió de la font, la naturalesa i el propòsit de la mostra, es pot fer un judici preliminar de la composició de la mostra i es poden utilitzar els mètodes següents per determinar el compost representat pel pic cromatogràfic.
1. Control qualitatiu mitjançant substàncies pures
En determinades condicions cromatogràfiques, una incògnita només té un temps de retenció definit.Per tant, la desconeguda es pot identificar qualitativament comparant el temps de retenció de la substància pura coneguda en les mateixes condicions cromatogràfiques amb el temps de retenció de la substància desconeguda.Si les dues són iguals, la substància desconeguda pot ser una substància pura coneguda;En cas contrari, la desconeguda no és la substància pura.
El mètode de control de substàncies pures només és aplicable a la substància desconeguda la composició de la qual s'ha conegut, la composició de la qual és relativament simple i la substància pura de la qual és coneguda.
2. Mètode del valor relatiu de retenció
El valor de retenció relativa α, fa referència a l'ajust entre el component i i els materials de referència. Relació dels valors de retenció:
Només canvia amb el canvi de temperatura del fixador i de la columna, i no té res a veure amb altres condicions de funcionament.
A una determinada temperatura de fase estacionària i columna, es mesuren els valors de retenció ajustats del component i i de la substància de referència s respectivament i després es calculen segons la fórmula anterior.Els valors de retenció relativa obtinguts es poden comparar qualitativament amb els valors corresponents de la literatura.
3, afegint substàncies conegudes per augmentar el mètode d'alçada màxima
Quan hi ha molts components a la mostra desconeguda, els pics cromatogràfics obtinguts són massa densos per ser identificats fàcilment amb el mètode anterior, o quan la mostra desconeguda només s'utilitza per a l'anàlisi de l'element especificat.
"Primer es fa un cromatograma d'una mostra desconeguda, i després s'obté un cromatograma més afegint una substància coneguda a la mostra desconeguda".Per a aquestes substàncies es poden conèixer components amb alçades de pic més elevades.
4. Mantenir el mètode qualitatiu de l'índex
L'índex de retenció representa el comportament de retenció de substàncies sobre fixadors i actualment és l'índex qualitatiu més utilitzat i reconegut internacionalment en GC.Té els avantatges d'una bona reproductibilitat, un estàndard uniforme i un coeficient de temperatura petit.
L'índex de retenció només està relacionat amb les propietats de la fase estacionària i la temperatura de la columna, però no amb altres condicions experimentals.La seva precisió i reproductibilitat són excel·lents.Sempre que la temperatura de la columna sigui la mateixa que la de la fase estacionària, es pot aplicar el valor de la literatura per a la identificació i no és necessari utilitzar el material pur per a la comparació.
(2) Anàlisi quantitativa
Bases per a la quantificació cromatogràfica:
La tasca de l'anàlisi quantitativa és trobar el centenar de components de la mostra mixta
Contingut fraccionat.La quantificació cromatogràfica es va basar en el següent: quan les condicions de funcionament eren coherents, era
La massa (o concentració) del component mesurat ve determinada pel senyal de resposta donat pel detector
És proporcional.És a dir:
Bases per a la quantificació cromatogràfica:
La tasca de l'anàlisi quantitativa és trobar el centenar de components de la mostra mixta
Contingut fraccionat.La quantificació cromatogràfica es va basar en el següent: quan les condicions de funcionament eren coherents, era
La massa (o concentració) del component mesurat ve determinada pel senyal de resposta donat pel detector
És proporcional.És a dir:
1. Mètode de mesura de l'àrea de pic
L'àrea màxima són les dades quantitatives bàsiques proporcionades pels cromatogrames, i la precisió de la mesura de l'àrea màxima afecta directament els resultats quantitatius.Es van utilitzar diferents mètodes de mesura per a pics cromatogràfics amb diferents formes de pic.
És difícil trobar el valor exacte de l'hivern en l'anàlisi quantitativa:
D'una banda per la dificultat de mesurar amb precisió el volum d'injecció absolut: de l'altra
L'àrea del pic depèn de les condicions cromatogràfiques i la banda cromatogràfica s'ha de mantenir quan es mesura el valor.
No és possible ni convenient fer el mateix.I encara que ho facis bé
El valor exacte, també perquè no hi ha cap estàndard unificat i no es pot aplicar directament.
2.Factor de correcció quantitatiu
Definició de factor de correcció quantitatiu: quantitat de components que entren al detector (m)
La relació entre l'àrea del pic cromatogràfic (A) o l'alçada del pic () és una constant de proporcionalitat (,
La constant de proporcionalitat s'anomena factor de correcció absolut del component.
És difícil trobar el valor exacte de l'hivern en l'anàlisi quantitativa:
D'una banda per la dificultat de mesurar amb precisió el volum d'injecció absolut: de l'altra
L'àrea del pic depèn de les condicions cromatogràfiques i la banda cromatogràfica s'ha de mantenir quan es mesura el valor.
No és possible ni convenient fer el mateix.I encara que ho facis bé
El valor exacte, també perquè no hi ha cap estàndard unificat i no es pot aplicar directament.
És a dir, el factor de correcció relatiu d'un component és el component i el material de referència s
La relació dels factors de correcció absoluts.
Es pot veure que el factor de correcció relatiu és quan la qualitat del component enfront de l'estàndard.
Quan la substància s és igual, l'àrea del pic del material de referència és l'àrea del pic del component
Múltiples.Si algun component té massa m i àrea de pic A, aleshores el nombre de f'A
Els valors són iguals a l'àrea del pic del material de referència amb una massa de.En altres paraules,
Mitjançant el factor de correcció relatiu, es poden separar les àrees pics de cada component
Convertit a l'àrea del pic del material de referència igual a la seva massa, després la relació
L'estàndard està unificat.Per tant, aquest és el mètode normalitzat per esbrinar el percentatge de cada component
La base de la quantitat.
Mètode d'obtenció del factor de correcció relatiu: els valors del factor de correcció relatiu només es van comparar amb ser
La mesura està relacionada amb l'estàndard i el tipus de detector, però amb la banda de funcionament
No importa.Per tant, els valors es poden recuperar a partir de referències a la literatura.Si el text
Si no trobeu el valor desitjat a l'oferta, també podeu determinar-lo vosaltres mateixos.Mètode de determinació
Mètode: una certa quantitat de la substància mesurada deu material de referència seleccionat → convertit en una determinada concentració
Es van mesurar les àrees de pic cromatogràfiques A i As dels dos components.
Aquesta és la fórmula.
3. Mètode de càlcul quantitatiu
(1) Mètode de normalització d'àrea
La suma del contingut de totes les fraccions lliures de pics es va calcular com a 100% per a la quantificació
El mètode s'anomena normalització.La seva fórmula de càlcul és la següent:
On P,% és el contingut percentual dels components provats;A1, A2... A n és el component 1. L'àrea del pic d'1~n;f'1, f'2... f'n és el factor de correcció relatiu per als components 1 a n.
(2) mètode estàndard extern
El mètode de comparació quantitativa entre el senyal de resposta del component a provar a la mostra i el component pur a provar com a control.
(3) Mètode estàndard intern
L'anomenat mètode estàndard intern és un mètode en què s'afegeix una certa quantitat de substància pura a la solució estàndard de la substància provada i la solució de mostra com a estàndard intern, i després s'analitza i es determina.
(3) mètode d'addició estàndard
El mètode d'addició estàndard, també conegut com a mètode d'addició interna, és afegir una certa quantitat de (△C)
La referència de la substància de prova es va afegir a la solució de mostra a provar i la prova es va afegir a l'assaig
El pic de la solució de mostra després de la substància era superior al de la solució de mostra original
L'increment de l'àrea (△A) es va utilitzar per calcular la concentració de la substància a la solució de mostra
Contingut (Cx)
On Ax és l'àrea del pic de la substància que s'ha de mesurar a la mostra original.
Hora de publicació: 27-mar-2023