Principis i mètodes d'anàlisi quantitativa per cromatografia líquida

El mecanisme de separació de la cromatografia líquida es basa en la diferència d'afinitat dels components de la mescla per les dues fases.

Segons les diferents fases estacionàries, la cromatografia líquida es divideix en cromatografia líquid-sòlid, cromatografia líquid-líquid i cromatografia en fase enllaçada.Les més utilitzades són la cromatografia líquid-sòlid amb gel de sílice com a farciment i la cromatografia en fase unida amb microsílice com a matriu.

Segons la forma de fase estacionària, la cromatografia líquida es pot dividir en cromatografia en columna, cromatografia en paper i cromatografia en capa fina.Segons la capacitat d'adsorció, es pot dividir en cromatografia d'adsorció, cromatografia de partició, cromatografia d'intercanvi iònic i cromatografia de permeació de gel.

En els darrers anys, s'ha afegit un sistema de flux líquid d'alta pressió al sistema de cromatografia de columna líquida per fer que la fase mòbil flueixi ràpidament a alta pressió per millorar l'efecte de separació, de manera que la cromatografia líquida d'alta eficiència (també coneguda com a alta pressió) ha sorgit.

PART
01 Principi d'Anàlisi Quantitativa de Cromatografia Líquida

Per quantificar sobre la base de qualitats, es requereixen substàncies pures com a estàndards;

La quantificació per cromatografia líquida és un mètode relativament quantitatiu: és a dir, la quantitat d'analit a la mescla s'estima a partir d'una quantitat coneguda de mostra estàndard pura.

PART
02 Bases per a la quantificació per cromatografia líquida

La quantitat del component mesurat (W) és proporcional al valor de resposta (A) (altura del pic o àrea del pic), W=f×A.

Factor de correcció quantitativa (f): És la constant de proporcionalitat de la fórmula de càlcul quantitatiu, i el seu significat físic és la quantitat del component mesurat representat pel valor de resposta de la unitat (àrea de pic).

El factor de correcció quantitatiu es pot obtenir a partir de la quantitat coneguda de mostra estàndard i el seu valor de resposta.

Mesureu el valor de resposta del component desconegut i la quantitat del component es pot obtenir mitjançant el factor de correcció quantitativa.

PART
03 Termes comuns en anàlisi quantitativa

Mostra (mostra): solució que conté un analit per a l'anàlisi cromatogràfica.Dividit en mostres estàndard i desconegudes.

Estàndard: producte pur amb una concentració coneguda.Mostra desconeguda (desconeguda): la mescla la concentració de la qual s'ha de provar.

Pes de la mostra: el pes original de la mostra a provar.

Dilució: el factor de dilució de la mostra desconeguda.

Component : el pic cromatogràfic a analitzar quantitativament, és a dir, l'analit del qual es desconeix el contingut.

Quantitat de component (quantitat): el contingut (o concentració) de la substància a provar.

Integeritat: el procés computacional de mesurar l'àrea del pic d'un pic cromatogràfic mitjançant un ordinador.

Corba de calibratge: una corba lineal de contingut de components versus valor de resposta, establerta a partir d'una quantitat coneguda de substància estàndard, utilitzada per determinar el contingut desconegut de l'analit.

PART
04 Anàlisi quantitativa de cromatografia líquida

1. Seleccioneu un mètode cromatogràfic adequat per a l'anàlisi quantitativa:

l Confirmeu el pic del component detectat i aconseguiu una resolució (R) superior a 1,5

l Determinar la consistència (puresa) dels pics cromatogràfics dels components provats

l Determinar el límit de detecció i el límit de quantificació del mètode;sensibilitat i rang lineal

2. Establir una corba de calibratge amb mostres estàndard de diferents concentracions

3. Comprovar l'exactitud i precisió dels mètodes quantitatius

4. Utilitzar el programari de gestió de cromatografia corresponent per implementar la recollida de mostres, el processament de dades i els resultats de l'informe

PART
05 Identificació de pics quantitatius (qualitatius)

Identificar qualitativament cada pic cromatogràfic a quantificar

Primer, utilitzeu la mostra estàndard per determinar el temps de retenció (Rt) del pic cromatogràfic a quantificar.Comparant el temps de retenció, trobeu el component corresponent a cada pic cromatogràfic de la mostra desconeguda.El mètode qualitatiu cromatogràfic consisteix a comparar el temps de retenció amb la mostra estàndard.El criteri Insuficientconfirmació addicional (qualitativa)

1. Mètode d'addició estàndard

2. Utilitzeu altres mètodes al mateix temps: altres mètodes cromatogràfics (canviar el mecanisme, com ara: utilitzar diferents columnes cromatogràfiques), altres detectors (PDA: comparació d'espectre, cerca de biblioteca d'espectre; MS: anàlisi d'espectre de masses, cerca de biblioteca d'espectre)

3. Altres instruments i mètodes

PART
06 Confirmació de la consistència del pic quantitatiu

Confirmeu la consistència del pic cromatogràfic (puresa)

Assegureu-vos que només hi ha un component mesurat sota cada pic cromatogràfic

Comproveu si hi ha interferències de substàncies coeluents (impureses)

Mètodes per a la confirmació de la consistència del pic cromatogràfic (puresa)

Comparació d'espectrogrames amb detectors de matriu de fotodiodes (PDA).

Identificació de la puresa màxima

2996 Teoria de l'angle de puresa

Mètodes quantitatius utilitzats habitualment a la PART 07

Mètode de corba estàndard, dividit en mètode estàndard extern i mètode estàndard intern:

1. Mètode estàndard extern: més utilitzat en cromatografia líquida

Es van preparar una sèrie de mostres estàndard de concentracions conegudes utilitzant mostres pures dels compostos a provar com a mostres estàndard.s'injecta a la columna fins al seu valor de resposta (àrea de pic).
Dins d'un determinat rang, hi ha una bona relació lineal entre la concentració de la mostra estàndard i el valor de resposta, és a dir, W= f × A , i es fa una corba estàndard.

En les mateixes condicions experimentals exactes, injecteu la mostra desconeguda per obtenir el valor de resposta del component a mesurar.Segons el coeficient f conegut, es pot obtenir la concentració del component a mesurar.

Els avantatges del mètode estàndard extern:operació i càlcul senzill, és un mètode quantitatiu d'ús habitual;no cal que cada component sigui detectat i eluït;es requereix una mostra estàndard;les condicions de mesura de la mostra estàndard i la mostra desconeguda han de ser coherents;el volum d'injecció ha de ser precís.

Desavantatges del mètode estàndard extern:Les condicions experimentals han de ser altes, com ara la sensibilitat del detector, el cabal i la composició de la fase mòbil no es poden canviar;el volum de cada injecció ha de tenir una bona repetibilitat.

2. Mètode estàndard intern: precís, però problemàtic, més utilitzat en mètodes estàndard

S'afegeix una quantitat coneguda de l'estàndard intern a l'estàndard per fer un estàndard mixt i es preparen una sèrie d'estàndards de treball de concentració coneguda.La relació molar de l'estàndard a l'estàndard intern en l'estàndard mixt es manté sense canvis.Injecteu a la columna cromatogràfica i preneu (àrea de pic de mostra estàndard/àrea de pic de mostra estàndard interna) com a valor de resposta.Segons la relació lineal entre el valor de resposta i la concentració de l'estàndard de treball, és a dir, W= f×A , es fa una corba estàndard.

S'afegeix una quantitat coneguda d'estàndard intern a la mostra desconeguda i s'injecta a la columna per obtenir el valor de resposta del component a mesurar.Segons el coeficient f conegut, es pot obtenir la concentració del component a mesurar.

Les característiques del mètode estàndard intern:Durant l'operació, la mostra i l'estàndard intern es barregen i s'injecten a la columna cromatogràfica, de manera que sempre que la relació entre la quantitat del component mesurat i l'estàndard intern a la solució mixta sigui constant, el canvi del volum de la mostra no afectarà els resultats quantitatius..El mètode estàndard intern compensa la influència del volum de la mostra, i fins i tot la fase mòbil i el detector, de manera que és més precís que el mètode estàndard extern.

PART
08 Factors que afecten els resultats de l'anàlisi quantitativa

La mala precisió pot ser causada per:

Integració incorrecta de l'àrea de pic, descomposició de la mostra o impureses introduïdes durant la preparació de la mostra, vial de mostra no segellat, volatilització de la mostra o del dissolvent, preparació incorrecta de la mostra, problemes d'injecció de la mostra, preparació de l'estàndard intern incorrecta

Possibles raons per a una mala precisió:

Integració de pics incorrecta, problemes d'injecció o injector, descomposició de la mostra o impureses introduïdes durant la preparació de la mostra, problemes cromatogràfics, resposta degradada del detector