La cromatografia líquida és el mètode principal per provar el contingut de cada component i les impureses en matèries primeres, intermedis, preparats i materials d'embalatge, però moltes substàncies no tenen mètodes estàndard en què confiar, per la qual cosa és inevitable desenvolupar nous mètodes. En el desenvolupament de mètodes de fase líquida, la columna cromatogràfica és el nucli de la cromatografia líquida, per la qual cosa és crucial com triar una columna cromatogràfica adequada. En aquest article, l'autor explicarà com triar una columna de cromatografia líquida des de tres aspectes: idees generals, consideracions i àmbit d'aplicació.
A.Idees generals per seleccionar columnes de cromatografia líquida
1. Avalueu les propietats físiques i químiques de l'analit: com ara estructura química, solubilitat, estabilitat (com ara si és fàcil d'oxidar/reduir/hidrolitzar), acidesa i alcalinitat, etc., especialment l'estructura química és la clau factor en la determinació de les propietats, com ara el grup conjugat té una forta absorció ultraviolada i una forta fluorescència;
2. Determineu el propòsit de l'anàlisi: si es requereix una alta separació, una alta eficiència de columna, un temps d'anàlisi curt, una alta sensibilitat, una resistència a alta pressió, una llarga vida útil de la columna, un baix cost, etc.;
- Trieu una columna cromatogràfica adequada: entengueu la composició, les propietats físiques i químiques del farciment cromatogràfic, com ara la mida de la partícula, la mida dels porus, la tolerància a la temperatura, la tolerància al pH, l'adsorció de l'analit, etc.
- Consideracions per a la selecció de columnes de cromatografia líquida
En aquest capítol es tractaran els factors que s'han de tenir en compte a l'hora de seleccionar una columna de cromatografia des de la perspectiva de les propietats físiques i químiques de la pròpia columna de cromatografia. 2.1 Matriu de farciment
2.1.1 Matriu de gel de sílice La matriu de farciment de la majoria de columnes de cromatografia líquida és gel de sílice. Aquest tipus de farciment té una puresa alta, un baix cost, una gran resistència mecànica i és fàcil de modificar grups (com ara enllaços fenil, enllaç amino, enllaç ciano, etc.), però el valor de pH i el rang de temperatura que tolera són limitats: el El rang de pH de la majoria dels farcits de matriu de gel de sílice és de 2 a 8, però el rang de pH de les fases d'unió de gel de sílice especialment modificades pot ser tan ampli com d'1,5 a 10, i també hi ha fases d'unió de gel de sílice especialment modificades que són estables a pH baix. com Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, que és estable a pH 1 a 8; el límit de temperatura superior de la matriu de gel de sílice sol ser de 60 ℃ i algunes columnes de cromatografia poden tolerar una temperatura de 40 ℃ a pH alt.
2.1.2 Matriu de polímer Els farcits de polímer són majoritàriament poliestirè-divinilbenzè o polimetacrilat. Els seus avantatges són que poden tolerar un ampli rang de pH: es poden utilitzar en el rang d'1 a 14, i són més resistents a les altes temperatures (pot arribar a superar els 80 °C). En comparació amb els farcits C18 a base de sílice, aquest tipus de farciment té una hidrofobicitat més forta i el polímer macroporós és molt eficaç per separar mostres com les proteïnes. Els seus desavantatges són que l'eficiència de la columna és menor i la resistència mecànica és més feble que la dels farcits a base de sílice. 2.2 Forma de partícula
La majoria dels farcits HPLC moderns són partícules esfèriques, però de vegades són partícules irregulars. Les partícules esfèriques poden proporcionar una pressió de columna més baixa, una major eficiència de la columna, estabilitat i una vida més llarga; quan s'utilitzen fases mòbils d'alta viscositat (com l'àcid fosfòric) o quan la solució de mostra és viscosa, les partícules irregulars tenen una àrea de superfície específica més gran, que és més propici per a l'acció total de les dues fases, i el preu és relativament baix. 2.3 Mida de partícula
Com més petita sigui la mida de la partícula, més gran serà l'eficiència de la columna i més gran serà la separació, però pitjor serà la resistència a l'alta pressió. La columna més utilitzada és la columna de mida de partícula de 5 μm; si el requisit de separació és alt, es pot seleccionar un farciment d'1,5-3 μm, que afavoreix la resolució del problema de separació d'algunes mostres de matriu complexa i multicomponent. UPLC pot utilitzar farcits d'1,5 μm; Sovint s'utilitzen farciments de partícules de 10 μm o més grans per a columnes semipreparatives o preparatives. 2.4 Contingut de carboni
El contingut de carboni es refereix a la proporció de fase unida a la superfície del gel de sílice, que està relacionada amb la superfície específica i la cobertura de la fase unida. L'alt contingut de carboni proporciona una gran capacitat de columna i una alta resolució, i sovint s'utilitza per a mostres complexes que requereixen una gran separació, però a causa del llarg temps d'interacció entre les dues fases, el temps d'anàlisi és llarg; Les columnes cromatogràfiques de baix contingut en carboni tenen un temps d'anàlisi més curt i poden mostrar diferents selectivitats, i sovint s'utilitzen per a mostres simples que requereixen una anàlisi ràpida i mostres que requereixen condicions de fase aquosa elevades. En general, el contingut de carboni de C18 oscil·la entre el 7% i el 19%. 2.5 Mida dels porus i superfície específica
Els mitjans d'adsorció per HPLC són partícules poroses i la majoria de les interaccions tenen lloc als porus. Per tant, les molècules han d'entrar als porus per ser adsorbides i separades.
La mida dels porus i la superfície específica són dos conceptes complementaris. La petita mida dels porus significa una gran superfície específica, i viceversa. Una gran superfície específica pot augmentar la interacció entre les molècules de mostra i les fases unides, millorar la retenció, augmentar la càrrega de la mostra i la capacitat de la columna i la separació de components complexos. Els farcits totalment porosos pertanyen a aquest tipus de farcits. Per a aquells amb alts requisits de separació, es recomana triar farcits amb una gran superfície específica; una petita superfície específica pot reduir la contrapressió, millorar l'eficiència de la columna i reduir el temps d'equilibri, que és adequat per a l'anàlisi del gradient. Els farcits de nucli de closca pertanyen a aquest tipus de farcits. A partir de la premissa d'assegurar la separació, es recomana escollir farcits amb una superfície específica reduïda per a aquells amb requisits d'eficiència d'anàlisi elevats. 2.6 Volum de porus i resistència mecànica
El volum de porus, també conegut com a "volum de porus", es refereix a la mida del volum buit per partícula unitat. Pot reflectir bé la resistència mecànica del farciment. La resistència mecànica dels farciments amb un gran volum de porus és lleugerament més feble que la dels farcits amb un volum de porus petit. Els farcits amb un volum de porus inferior o igual a 1,5 ml/g s'utilitzen principalment per a la separació HPLC, mentre que els farcits amb un volum de porus superior a 1,5 ml/g s'utilitzen principalment per a la cromatografia d'exclusió molecular i la cromatografia de baixa pressió. 2.7 Taxa de límit
El tapat pot reduir els pics de cau causats per la interacció entre compostos i grups silanols exposats (com ara l'enllaç iònic entre compostos alcalins i grups silanol, forces de van der Waals i enllaços d'hidrogen entre compostos àcids i grups silanol), millorant així l'eficiència de la columna i la forma del pic. . Les fases unides sense taponar produiran diferents selectivitats respecte a les fases unides tapes, especialment per a mostres polars.
- Àmbit d'aplicació de diferents columnes de cromatografia líquida
En aquest capítol es descriu l'àmbit d'aplicació de diferents tipus de columnes de cromatografia líquida a través d'alguns casos.
3.1 Columna cromatogràfica C18 de fase inversa
La columna C18 és la columna de fase inversa més utilitzada, que pot complir les proves de contingut i impureses de la majoria de substàncies orgàniques, i és aplicable a substàncies de polaritat mitjana, poc polar i no polar. El tipus i l'especificació de la columna cromatogràfica C18 s'han de seleccionar segons els requisits específics de separació. Per exemple, per a substàncies amb requisits de separació elevats, sovint s'utilitzen especificacions de 5 μm * 4,6 mm * 250 mm; per a substàncies amb matrius de separació complexes i polaritat similar, es poden utilitzar especificacions de 4 μm * 4,6 mm * 250 mm o mides de partícules més petites. Per exemple, l'autor va utilitzar una columna de 3 μm * 4,6 mm * 250 mm per detectar dues impureses genotòxiques a l'API de celecoxib. La separació de les dues substàncies pot arribar a 2,9, la qual cosa és excel·lent. A més, sota la premissa de garantir la separació, si es requereix una anàlisi ràpida, sovint es selecciona una columna curta de 10 mm o 15 mm. Per exemple, quan l'autor va utilitzar LC-MS/MS per detectar una impuresa genotòxica en l'API de fosfat de piperaquina, es va utilitzar una columna de 3 μm * 2,1 mm * 100 mm. La separació entre la impuresa i el component principal va ser de 2,0 i la detecció d'una mostra es pot completar en 5 minuts. 3.2 Columna de fenil de fase inversa
La columna de fenil també és un tipus de columna de fase inversa. Aquest tipus de columna té una forta selectivitat per als compostos aromàtics. Si la resposta dels compostos aromàtics mesurats per la columna C18 ordinària és feble, podeu considerar substituir la columna de fenil. Per exemple, quan estava fent celecoxib API, la resposta del component principal mesurada per la columna de fenil del mateix fabricant i la mateixa especificació (tots 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) era aproximadament 7 vegades la de la columna C18. 3.3 Columna de fase normal
Com a complement eficaç a la columna de fase inversa, la columna de fase normal és adequada per a compostos altament polars. Si el pic encara és molt ràpid quan s'elueix amb més del 90% de fase aquosa a la columna de fase inversa, i fins i tot a prop i se superposa al pic de dissolvent, podeu considerar substituir la columna de fase normal. Aquest tipus de columna inclou columna hílica, columna amino, columna ciano, etc.
3.3.1 Columna hillica La columna hillica normalment incrusta grups hidròfils a la cadena alquil enllaçada per millorar la resposta a les substàncies polars. Aquest tipus de columna és adequada per a l'anàlisi de substàncies de sucre. L'autor va utilitzar aquest tipus de columnes a l'hora de fer el contingut i les substàncies relacionades de la xilosa i els seus derivats. Els isòmers d'un derivat de xilosa també es poden separar bé;
3.3.2 Columna amino i columna ciano La columna amino i la columna ciano es refereixen a la introducció de modificacions amino i ciano al final de la cadena d'alquil unida, respectivament, per millorar la selectivitat per a substàncies especials: per exemple, la columna amino és una bona opció per a la separació de sucres, aminoàcids, bases i amides; La columna ciano té una millor selectivitat a l'hora de separar substàncies estructurals similars hidrogenades i no hidrogenades a causa de la presència d'enllaços conjugats. La columna d'amino i la columna de ciano sovint es poden canviar entre la columna de fase normal i la columna de fase inversa, però no es recomana el canvi freqüent. 3.4 Columna quiral
La columna quiral, com el seu nom indica, és adequada per a la separació i anàlisi de compostos quirals, especialment en l'àmbit farmacèutic. Aquest tipus de columna es pot considerar quan les columnes convencionals de fase inversa i de fase normal no poden aconseguir la separació d'isòmers. Per exemple, l'autor va utilitzar una columna quiral de 5 μm * 4,6 mm * 250 mm per separar els dos isòmers de la 1,2-difeniletilendiamina: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamina i (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiamina, i la separació entre ambdues va arribar a uns 2,0. Tanmateix, les columnes quirals són més cares que altres tipus de columnes, normalment 1W+/peça. Si calen aquestes columnes, la unitat ha de fer un pressupost suficient. 3.5 Columna d'intercanvi iònic
Les columnes d'intercanvi iònic són adequades per a la separació i anàlisi d'ions carregats, com ara ions, proteïnes, àcids nucleics i algunes substàncies de sucre. Segons el tipus de farciment, es divideixen en columnes d'intercanvi catiònic, columnes d'intercanvi d'anions i columnes d'intercanvi catiònic fort.
Les columnes d'intercanvi catiònic inclouen columnes basades en calci i hidrogen, que són adequades principalment per a l'anàlisi de substàncies catiònics com els aminoàcids. Per exemple, l'autor va utilitzar columnes basades en calci quan va analitzar el gluconat de calci i l'acetat de calci en una solució de rentat. Ambdues substàncies van tenir respostes fortes a λ=210nm i el grau de separació va arribar a 3,0; l'autor va utilitzar columnes basades en hidrogen en analitzar substàncies relacionades amb la glucosa. Diverses substàncies relacionades principals (maltosa, maltotriosa i fructosa) tenien una alta sensibilitat amb detectors diferencials, amb un límit de detecció tan baix com 0,5 ppm i un grau de separació de 2,0-2,5.
Les columnes d'intercanvi aniònic són adequades principalment per a l'anàlisi de substàncies aniòniques com els àcids orgànics i els ions halogens; Les columnes d'intercanvi catiònic fortes tenen una capacitat i selectivitat d'intercanvi iònic més elevats i són adequades per a la separació i anàlisi de mostres complexes.
L'anterior és només una introducció als tipus i rangs d'aplicació de diverses columnes de cromatografia líquida habituals combinades amb la pròpia experiència de l'autor. Hi ha altres tipus especials de columnes cromatogràfiques en aplicacions reals, com ara columnes cromatogràfiques de porus grans, columnes cromatogràfiques de porus petits, columnes de cromatografia d'afinitat, columnes cromatogràfiques multimode, columnes de cromatografia líquida d'ultra-alt rendiment (UHPLC), columnes de cromatografia de fluids supercrítics ( SFC), etc. Tenen un paper important en diferents àmbits. El tipus específic de columna cromatogràfica s'ha de seleccionar segons l'estructura i les propietats de la mostra, els requisits de separació i altres finalitats.
Hora de publicació: 14-juny-2024